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高通量测序

发布日期:2018-07-28 10:38:05

高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术("Next-generation" sequencing technology),以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变,一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定,因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing)足见其划时代的改变,同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,所以又被称为深度测序(deepsequencing)。

 

Illumina Genome AnalyzerIIx测序原理:Illumina公司的新一代测序仪Hiseq 2000和Hiseq 2500具有高准确性,高通量,高灵敏度,和低运行成本等突出优势,可以同时完成传统基因组学研究(测序和注释)以及功能基因组学(基因表达及调控,基因功能,蛋白/核酸相互作用)研究。Hiseq是一种基于单分子簇的边合成边测序技术,基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面(即Flow cell),这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后,在Flow cell上形成了数以亿计Cluster,每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸,通过可逆性终止的SBS(边合成边测序)技术对待测的模板DNA进行测序。

 

测序技术推进科学研究的发展。随着第二代测序技术的迅猛发展,科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行从头测序(de novo sequencing),获得该物种的参考序列,为后续研究和分子育种奠定基础;对有参考序列的物种,进行全基因组重测序(resequencing),在全基因组水平上扫描并检测突变位点,发现个体差异的分子基础。在转录组水平上进行全转录组测序(whole transcriptome resequencing),从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性(cSNP)等研究;或者进行小分子RNA测序(small RNA sequencing),通过分离特定大小的RNA分子进行测序,从而发现新的microRNA分子。在转录组水平上,与染色质免疫共沉淀(ChIP)和甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIP)技术相结合,从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。

 

这边需要特别指出的是第二代测序结合微阵列技术而衍生出来的应用--目标序列捕获测序技术(Targeted Resequencing)。这项技术首先利用微阵列技术合成大量寡核苷酸探针,这些寡核苷酸探针能够与基因组上的特定区域互补结合,从而富集到特定区段,然后用第二代测序技术对这些区段进行测序。目前提供序列捕获的厂家有Agilent和Nimblegen ,应用最多的是人全外显子组捕获测序。科学家们目前认为外显子组测序比全基因组重测序更有优势,不仅仅是费用较低,更是因为外显子组测序的数据分析计算量较小,与生物学表型结合更为直接。

 

目前,高通量测序开始广泛应用于寻找疾病的候选基因上。内梅亨大学的研究人员使用这种方法鉴定出Schinzel-Giedion 综合征中的致病突变,Schinzel-Giedion综合征是一种导致严重的智力缺陷、肿瘤高发以及多种先天性畸形的罕见病。他们使用Agilent SureSelect序列捕获和SOLiD对四位患者的外显子组进行测序,平均覆盖度为43倍,读长为50 nt,每个个体产生了2.7-3 GB可作图的序列数据。他们聚焦于全部四位患者都携带变异体的12个基因,最终将候选基因缩小至1个。而贝勒医学院基因组测序中心也计划对15种以Science杂志年度十大科学突破上疾病进行研究,包括脑癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、心脏病、糖尿病、自闭症以及其他遗传疾病,以更好地理解致病突变以及突变对疾病的影响。前不久刚刚结束的评选中,外显子组测序名列其中。

 

 

高通量测序技术的诞生可以说是基因组学研究领域一个具有里程碑意义的事件。该技术使得核酸测序的单碱基成本与第一代测序技术相比急剧下降, 以人类基因组测序为例, 上世纪末进行的人类基因组计划花费 30 亿美元解码了人类生命密码, 而第二代测序使得人类基因组测序已进入万(美)元基因组时代。如此低廉的单碱基测序成本使得我们可以实施更多物种的基因组计划从而解密更多生物物种的基因组遗传密码。同时在已完成基因组序列测定的物种中, 对该物种的其他品种进行大规模地全基因组重测序也成为了可能。

 

 

本公司具有的高通量测序平台:

l Illumina HiSeq 2500:高通量测序平台,拥有高通量运行和快速运行两种模式,提供多种读长选择,也可使用一个或两个流动槽,使之成为一个灵活且可扩展的平台。高产量模式单次运行可以产出600Gb数据,适合样品量较多,或需要最深度覆盖的应用。快速运行模式最多能在一天之内产生100Gb左右的数据 ,提供2×150bp的测序读长,有助于改善denovo应用的组装效果。

l Illumina MiSeq:是目前唯一一台在单个仪器上整合了扩增、测序和数据分析的新一代测序仪,每次运行能产生超过7Gb的数据,测序读长2×250bp,MiSeq有着革命性的流程和无可比拟的准确性,是快速且经高效的遗传分析理想平台。

高通量测序在基因组研究中的优势:

Ø 无需构建质粒克隆文库,避免了文库构建过程中由于克隆引起的偏差简化了操作,提高了效率;

Ø 通量高,同时进行多通道测序,节约了测序时间,提高了效率;

Ø 其边合成边测序法,明显优于第一代Sanger链终止测序法,明显降低了基因组测序成本及速度;

Ø 能够对群落中微生物的多样性作更为深入和全面的研究分析;

Ø 可以开展不可培养的微生物基因组的研究,对于寻找新型菌株以及功能基因具有不可替代的技术优势。

 

 

 

代表性学术论文:

1、Shi P, Jia S, Zhang X X, et al. Metagenomic insights into chlorination effects on microbial antibiotic resistance in drinking water[J]. Water research, 2013, 47(1): 111-120.

2、Jia S, Wang Z, Zhang X X, et al. Metagenomic analysis of cadmium and copper resistance genes in activated sludge of a tannery wastewater treatment plant[J]. Journal of Environmental Biology, 2013, 34.

3、Degnan P H, Ochman H. Illumina-based analysis of microbial community diversity[J]. The ISME journal, 2012, 6(1): 183-194.

4、Caporaso J G, Lauber C L, Walters W A, et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms[J]. The ISME journal, 2012, 6(8): 1621-1624.

 

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